南宫28NG相信品牌力量，细胞冻存是一种通过低温条件保存细胞的方法，旨在长时间保持细胞的活性和功能。这一技术对于细胞系的长期保存、实验重复性、基因库的建立及细胞治疗的储备等方面都发挥着重要作用。通过实施冻存，可以有效减少细胞传代过程中的遗传变异，同时避免因污染、环境变化或实验操作失误所导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是细胞处于最佳生长状态时。

冷冻保护剂是细胞冻存中的一个关键元素，常用的包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要功能是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而保护细胞免受冰晶带来的机械损伤。DMSO是一种广泛应用的冷冻保护剂，适合大多数细胞类型，不过某些细胞对DMSO较为敏感，此时可以考虑用甘油作为替代。

第一阶段 冷冻保存 实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型等信息。

2. 对于贴壁细胞，首先去除细胞培养基，并用PBS清洗；接着添加适量的胰蛋白酶覆盖细胞，在37°C的培养箱中孵育约2分钟。添加等量的培养基来终止消化过程，用移液枪轻轻吹打细胞，将其冲洗下并转移到50mL Falcon管中。

3. 对于悬浮细胞，直接将所需体积的细胞转移到50mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以确定其活力，要求冻存细胞的活力至少为75%。

5. 室温下以300× g离心5分钟。

6. 准备冷冻培养基，见表1。

表1 不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

细胞类型：在含有FBS的培养基中培养的细胞
冻存培养基配方：90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
细胞类型：在无血清培养基中培养的细胞
冻存培养基配方：90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
细胞类型：需要甘油冷冻的细胞
冻存培养基配方：90%胎牛血清 + 10%甘油

使用前混合均匀并加热至37°C。冷冻培养基中含有必要的冷冻保护剂，如DMSO，以防止形成对细胞膜和成分造成损害的冰晶。

7. 去除上清液。

8. 添加冻存培养基至所需的细胞密度，通常为1×10⁶/mL的冻存液。细胞在冻存液中的室温放置时间不应超过10分钟。

9. 将1mL样品分装到冷冻管中，并盖紧盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒，再放入-80°C的冰箱，冷冻盒外周添加适量的异丙醇，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢冷冻（每分钟降温-1ºC）有助于防止细胞内形成冰晶。

11. 约24小时后，将冷冻管从冷冻盒中取出并转移到液氮中进行长期储存。通常，冷冻细胞可以在液氮中保存数年。理想情况下，冷冻细胞不应在-80ºC下长时间保存（最多一周），并应尽快转移到液氮中，以避免细胞活力的损害。

第二阶段 解冻冷冻细胞系 实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，并迅速放入37°C水浴中，直到解冻约80%（切勿在室温下解冻）。此过程不应超过1分钟，以免细胞受损。由于DMSO具有一定的细胞毒性，细胞应快速解冻以便迅速稀释和去除DMSO。

2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至含有约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300× g离心5分钟，弃上清液后用适量的培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移至培养容器中，随后转移到37°C培养箱中培养。